Σελίδες

Κυριακή 23 Ιανουαρίου 2022

Ιικό φορτίο και τιμές Ct – Πώς χρησιμοποιούμε ποσοτικά την ποσοτική PCR;

 Ράφι δοκιμαστικών σωλήνων

Περίπου 192 δισεκατομμύρια τεστ COVID έχουν διεξαχθεί παγκοσμίως τους τελευταίους 16 μήνες – στην πλειονότητά τους τεστ RTqPCR – και κάθε ένα από αυτά έχει αναφερθεί στους ασθενείς ως αποτέλεσμα είτε/ή: θετικό ή, συνηθέστερα, αρνητικό.

Ωστόσο, το "q" στο RTqPCR μετρά το "ποσοτικό" ιικό φορτίο που γνωρίζουμε ότι έχει μεγάλη σημασία, και κάθε RTqPCR παρέχει το "q" ως προς την τιμή Ct. Γιατί απορρίπτουμε συστηματικά αυτά τα δεδομένα που είναι απολύτως κρίσιμα τόσο για τη δημόσια υγεία όσο και για τις κλινικές αποφάσεις; Χωρίς ένα πρότυπο apples-to-apples για σύγκριση των αποτελεσμάτων RTqPCR, ένα άτομο με υψηλό ιικό φορτίο 3.000.000 αντίγραφα/ml θα έχει το ίδιο θετικό εργαστηριακό αποτέλεσμα με ένα άλλο με χαμηλά 50 αντίγραφα/ml. Οι κλινικές συνέπειες και οι συνέπειες στη δημόσια υγεία αυτών των δύο αποτελεσμάτων είναι οριστικά πολύ διαφορετικές.

Όσο μεγαλύτερο είναι το ιικό φορτίο , τόσο μεγαλύτερη είναι η πιθανότητα σοβαρής ασθένειας, εισαγωγής στο νοσοκομείο και μετάδοσης σε άλλους, παρά τις μη φαρμακευτικές παρεμβάσεις (ΜΦΙ), όπως η φυσική απόσταση, η χρήση μάσκας, οι

καλά αεριζόμενοι χώροι ή η καραντίνα. Όσο χαμηλότερο είναι το ιικό φορτίο, τόσο πιο πιθανό είναι ο ασθενής να μην είναι σε θέση να μεταδώσει τον ιό.

Ασυμπτωματικοί ασθενείςκαι όσοι έχουν μόνο ήπια συμπτώματα είναι λιγότερο πιθανό να μεταδώσουν τον ιό σε άλλους, επειδή υπάρχει λιγότερος ιός που μεταδίδεται με αεροζόλ στα αναπνευστικά σταγονίδια. Όλοι οι ασθενείς θα βγουν θετικοί πολύ μετά από οποιαδήποτε πιθανότητα μεταδοτικής λοίμωξης. Οι ασθενείς που αναρρώνουν από το COVID-19 συχνά παραμένουν θετικοί στην PCR για ημέρες ή εβδομάδες, ακόμη και έως και έξι μήνες, όταν ο ιός που ανιχνεύεται μπορεί να είναι μόνο υπολειμματικά θραύσματα ιού. Τα πρώτα στοιχεία που μπορεί να λάβουν αυτοί οι ασθενείς είναι όταν κάνουν μια απαιτούμενη εξέταση PCR δύο ημέρες πριν από μια πτήση και μετά ανακαλύπτουν ότι είναι «θετικοί» καθώς φεύγουν για το αεροδρόμιο.

Υπάρχει ευρέως διαδεδομένη συναίνεση ότι οι συχνές κοινοτικές δοκιμές ενώ περιμένετε είναι καλύτερο να ξεκινήσουν τόσο κλινικές όσο και δράσεις δημόσιας υγείας των ασθενών. Η παραδοσιακή εργαστηριακή δοκιμή RTqPCR μεγάλου όγκου αποκλείεται αυτόματα. Είναι πολύ ακριβό για να χρησιμοποιείται «συχνά» και πολύ αργό για να είναι «ενώ περιμένετε». Τα πιο γρήγορα αποτελέσματα χρειάζονται 12-24 ώρες και, κατά τη διάρκεια της κορύφωσης της επιδημίας, επεκτάθηκε σε 7-14 ημέρες, αφήνοντας ουσιαστικά αυτήν την προσέγγιση δοκιμών άχρηστη, εκτός από την ενημέρωση μιας ιστορικής προοπτικής. Οι γρήγορες δοκιμές αντιγόνου είναι αρκετά φθηνές για να χρησιμοποιούνται συχνά και αρκετά ευαίσθητες (~95%) ώστε να είναι θετικές στην περίοδο του υψηλότερου ιικού φορτίου όταν τα άτομα είναι μολυσματικά.  

Πώς κρίνουμε ποιο επίπεδο ιικού φορτίου είναι μολυσματικό; Κάθε μολυσματική ασθένεια έχει μια ελάχιστη ποσότητα ιού που είναι απαραίτητη για να επικρατήσει μια μόλυνση. Αυτό διαφέρει ανάλογα με τον ιό και την ανοσολογική ικανότητα ενός ατόμου. Το χρυσό πρότυπο του εργαστηρίου για τον προσδιορισμό αυτού είναι η μόλυνση μιας κυτταρικής καλλιέργειας με τον ιό SARS-CoV2. Αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι οπουδήποτε από 1.000 έως 100.000 ιογενή αντίγραφαανά χιλιοστόλιτρο απαιτούνται για τη δημιουργία βιώσιμης λοίμωξης COVID-19. 

Υπάρχουν προειδοποιήσεις σε αυτές τις εργαστηριακές δοκιμές in vitro: Οι στόχοι κυττάρων που έχουν αναπτυχθεί στο εργαστήριο μπορεί να μην είναι αντιπροσωπευτικοί των κυττάρων σε ασθενείς. Οι συνθήκες ανάπτυξης του εργαστηρίου βελτιστοποιούνται τεχνητά. Δεν υπάρχει έμφυτη ή προσαρμοστική ανοσολογική αντίδραση σε ένα τρυβλίο Petri. κ.λπ. Ωστόσο, αυτό το όριο είναι συνεπές με την κλινική εμπειρία. Πολύ λίγοι ασθενείς με μέτρια έως σοβαρή νόσο δείγμα κάτω από αυτό το επίπεδο. (Δείτε το προηγούμενο ιστολόγιό μας με τίτλο «Ακρίβεια δοκιμής COVID-19: Πότε το πολύ καλό πράγμα είναι καταστροφή; » για μια πληρέστερη συζήτηση αυτών των ζητημάτων και μια βιβλιογραφία.) 


Γράφημα ιικού φορτίου

Η μεγαλύτερη ευαισθησία της PCR εντοπίζει μόλυνση αφού οι ασθενείς δεν είναι πλέον ικανοί να μολύνουν άλλους. New England Journal of Medicine, Rethinking Covid-19 Test Sensitivity, 30 Σεπτεμβρίου 2020

 

Γιατί να κάνετε καθόλου δοκιμές RTqPCR; Επειδή το "q" είναι σημαντικό με δύο τρόπους: την ενημέρωση της κλινικής φροντίδας ενός ασθενούς και, εάν μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό ατόμων που προορίζονται να μεταδοθούν αρκετά νωρίς, βοηθώντας στην πρόληψη της μετάδοσης. Το βασικό ερώτημα είναι πόσο διαρκεί το προ-μολυσματικό στάδιο; Είναι πολύ μικρό όπως φαίνεται εδώ (πράσινο τμήμα) ( NEJM Σεπτέμβριος 2020 ) ή είναι μεγαλύτερο; Εάν η άνοδος είναι γρήγορη και απότομη, η πιθανότητα οποιουδήποτε προ-μολυσματικού ατόμου να υποβληθεί αρκετά γρήγορα σε ένα παραδοσιακό τεστ υψηλής ευαισθησίας είναι ολοένα και μικρή. 

Είναι δύσκολο να βρεθούν αξιόπιστα δεδομένα, καθώς πολύ λίγοι άνθρωποι εντοπίζονται αρκετά νωρίς ώστε να ξεκινήσουν οι συχνές επαναλαμβανόμενες δοκιμές που απαιτούνται για την παροχή τους.  Πρόσφατες αναφορές περιπτώσεωναπό το CalTech/Pasadena DPH προτείνουν ότι αυτή η ανιχνεύσιμη προ-μολυσματική περίοδος μπορεί να είναι έως και τέσσερις ημέρες, ειδικά μεταξύ των νεότερων ατόμων, γεγονός που συνεπάγεται υψηλότερη αξία για τον εντοπισμό ατόμων πριν μπορέσουν να μολύνουν άλλα άτομα. Αυτό ενισχύει την ανάγκη είτε για ταχεία δοκιμή σειράς αντιγόνων ( ανακοίνωση FDA ) είτε για υψηλότερη ευαισθησία (103 ιικά αντίγραφα/ml ή καλύτερα) αναδυόμενα νέα μοριακά τεστ POC (δηλ. αληθινά συστήματα PCR, πιο ευαίσθητα από τα περισσότερα τρέχοντα συστήματα POC LAMP).  

Οι δοκιμές PCR είναι εξαιρετικά ευαίσθητες. Η διάμεση δοκιμή μπορεί να ανιχνεύσει ένα γονιδίωμα σε ένα μικρολίτρο δείγματος. Τα καλύτερα είναι 100 φορές πιο ευαίσθητα. το χειρότερο 100 φορές λιγότερο, αλλά ακόμη και αυτά εξακολουθούν να είναι σε θέση να ανιχνεύσουν τη συντριπτική πλειοψηφία των μολυσμένων ατόμων. Κάθε δοκιμή αναφέρει ένα "q:" το όριο του κύκλου (Ct, γνωστό και ως Cq ή Cp). 

Ωστόσο, οι ιδιαιτερότητες του πρωτοκόλλου δοκιμής επηρεάζουν το τι είναι αυτό το Ct. Το ίδιο δείγμα που δοκιμάστηκε με διαφορετικά πρωτόκολλα πιθανότατα δεν θα δημιουργήσει συγκρίσιμους αριθμούς Ct . Θα ποικίλλει από πρωτόκολλο σε πρωτόκολλο με βάση τις διαφορές στις διαδικασίες πριν από την PCR (συλλογή δειγμάτων, χρήση μέσου μεταφοράς, δημιουργία cDNA, επιλογή αντιδραστηρίου και καθαρότητα). τοποθεσίες και το βασικό περιεχόμενο των περιοχών γονιδιώματος που έχουν επιλεγεί·σχεδιασμός ασταριού για τη γεφύρωση αυτών των περιοχών (π.χ. σύνδεση εκτός στόχου ή σχηματισμός ασταριού-διμερούς). σχεδιασμός ανιχνευτή για την ανίχνευση ενισχυμένου προϊόντος. αποδοτικότητατου χρησιμοποιούμενου οργάνου κυκλοποιητή PCR· κ.λπ. Σε όλα τα δείγματα που εκτελούνται με το ίδιο πρωτόκολλο, η Ct θα αντικατοπτρίζει με ακρίβεια τις σχετικές διαφορές ιικού φορτίου από δείγμα σε δείγμα. Η δημιουργία συγκρισιμότητας πέρα ​​από αυτό απαιτεί από κάθε εργαστήριο να δημοσιεύει αυτό που ονομάζεται "Τυπική καμπύλη" για κάθε πρωτόκολλο δοκιμής που εκτελεί. 

Αυτό μεταφράζει τις μετρήσεις Ct «μήλα και πορτοκάλια» σε πιο συγκρίσιμα ιικά φορτία που εκφράζονται σε όρους αριθμού αντιγράφων ιού ανά χιλιοστόλιτρο. Αυτό γίνεται με τη λήψη δείγματος γνωστής ιικής συγκέντρωσης (διατίθεται στο εμπόριο) και την εκτέλεση μιας σειράς αραιώσεων 10x στο ίδιο πρωτόκολλο και την καταγραφή του προκύπτοντος Ct με κάθε γνωστό επίπεδο ιικού φορτίου για τη συγκεκριμένη δοκιμή, που εκτελείται με αυτόν τον συγκεκριμένο τρόπο, με το συγκεκριμένο εργαστήριο. 

Γράφημα ιικού φορτίου

Φορτίο ιού (10 x Αντίγραφα/MilliLeter)

 

Ως επίδειξη, σχεδιάσαμε την Ct έναντι του ιικού φορτίου για μια λίγο πολύ τυχαία ομάδα οκτώ αναλύσεων που αναφέρονται στην ακαδημαϊκή βιβλιογραφία. Η συντριπτική πλειονότητά τους έχει παρόμοιες κλίσεις επειδή όλες χρησιμοποιούν PCR, η οποία με 100% απόδοση διπλασιάζει το ενισχυμένο προϊόν με κάθε κύκλο. Ωστόσο, έχουν πολύ διαφορετικούς αριθμούς Ct τομής. Ένας αναφερόμενος 20Ct για το πιο ευαίσθητο πρωτόκολλο συνεπάγεται σχετικά λιγότερο μεταδιδόμενο 1.000 έως 10.000 (103-104) αντίγραφα/ml στο δείγμα, ενώ ένα φαινομενικά πανομοιότυπο 20Ct για το λιγότερο ευαίσθητο πρωτόκολλο σημαίνει ένα εξαιρετικά μολυσματικό 10.000.000 ml/1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 σε 100. το δείγμα. 

Σε 100.000 (105) ιικά αντίγραφα/ml ο αριθμός Ct ποικίλλει από 18Ct έως 32Ct. Το να μιλάμε για ιικό φορτίο μόνο με όρους Ct είναι παραπλανητικό και ουσιαστικά χωρίς νόημα πέρα ​​από τα όρια οποιουδήποτε μεμονωμένου πρωτοκόλλου ανάλυσης,εκτός εάν δημιουργηθεί η τυπική καμπύλη και η Ct μεταφραστεί σε ιικό φορτίο. (Εξακολουθούν να εξακολουθούν να υπάρχουν μη αναλυτικά ζητήματα που μπορούν να διαβρώσουν τη συγκρισιμότητα, για παράδειγμα: το SARS-C0V-2 είναι εγκατεστημένο στον ιστό, επομένως το διαθέσιμο φορτίο για δείγμα από την αναπνευστική οδό μπορεί να μην αντικατοπτρίζει άμεσα τα κλινικά αποτελέσματα που οδηγεί σε ενεργό ιό για τον ασθενή και τον κίνδυνο εμφάνισης μεταδοτικότητα.)

Όλα τα εργαστήρια υπολογίζουν μια τυπική καμπύλη ως μέρος της ανάλυσης/βαθμονόμησης οργάνου για ποσοτικές αναλύσεις που έχουν εκκαθαριστεί από το FDA. Ωστόσο, αυτός ο τύπος βαθμονόμησης δεν απαιτείται και σπάνια εκτελείται για ποιοτικές αναλύσεις, ακόμη κι αν, όπως συμβαίνει, οι δοκιμές qPCR είναι εγγενώς και ισχυρά ποσοτικές. Οι τρέχουσες αναλύσεις SARS-CoV-2 εγκρίνονται μόνο για απαντήσεις ναι ή όχι. Ο FDA δεν επέτρεψε ποτέ στο παρελθόν την αναφορά ενός ποσοτικού αποτελέσματος από μια ποιοτική δοκιμή ιών χωρίς να απαιτείται η βαθμονομημένη τυπική καμπύλη σε ιικά αντίγραφα/ml στην οποία βασίζεται η απάντηση ναι/όχι, και επομένως επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ των δοκιμών. Οι καμπύλες βαθμονόμησης SARS-CoV-2 για κάθε μεμονωμένη ανάλυση καθορίζονται εύκολα με τα κατάλληλα πρότυπα.

Πολλά είναι εμπορικά διαθέσιμα ή έχουν καθιερωθεί από κλινικά εργαστήρια με ενδιαφέρον για την ισχυρή κατανόηση της απόδοσης των αναλύσεων SARS-CoV-2 PCR. Ωστόσο, αυτά τα βασικά δεδομένα αναφέρονται σπάνια. Ορισμένες ενδείξεις εμφανίζονται στα όρια των ισχυρισμών ανίχνευσης, αλλά πολύ λίγες τυπικές καμπύλες δημοσιεύονται εκτός της ακαδημαϊκής βιβλιογραφίας. Είναι απογοητευτικό και τραγικό να αγνοείται το κύριο (ίσως μόνο) πλεονέκτημα της qPCR. Οι πρακτικές πρέπει να αλλάξουν ώστε να απαιτείται μια τυποποιημένη μέτρηση ιικού φορτίου να αναφέρεται τακτικά σε γιατρούς, επιδημιολόγους και ασθενείς για να ενημερώνουν τις κρίσιμες αποφάσεις τους.Είναι απογοητευτικό και τραγικό να αγνοείται το κύριο (ίσως μόνο) πλεονέκτημα της qPCR. Οι πρακτικές πρέπει να αλλάξουν ώστε να απαιτείται μια τυποποιημένη μέτρηση ιικού φορτίου να αναφέρεται τακτικά σε γιατρούς, επιδημιολόγους και ασθενείς για να ενημερώνουν τις κρίσιμες αποφάσεις τους.Είναι απογοητευτικό και τραγικό να αγνοείται το κύριο (ίσως μόνο) πλεονέκτημα της qPCR. Οι πρακτικές πρέπει να αλλάξουν ώστε να απαιτείται μια τυποποιημένη μέτρηση ιικού φορτίου να αναφέρεται τακτικά σε γιατρούς, επιδημιολόγους και ασθενείς για να ενημερώνουν τις κρίσιμες αποφάσεις τους. 

πηγή

Δεν υπάρχουν σχόλια:

Δημοσίευση σχολίου